Salina ipertonica Terapia in cistica …

Salina ipertonica Terapia in cistica ...

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PROCEDURE SPERIMENTALI

Fisher ratto tiroide (FRT) cellule epiteliali stabilmente trasfettate sia con il plasmide di controllo (codificante proteina fluorescente giallo) o con plasmidi codificanti AQP1, AQP3 o AQP4 (14) sono state coltivate in F-12 / media Coombs (Sigma-Aldrich) supplementato con 10 siero fetale bovino% (Hyclone), penicillina G (100 unità / ml), streptomicina (100 mcg / ml), ed i marcatori di selezione antibiotici appropriati. Per gli esperimenti di diluizione di tintura, le cellule FRT sono stati placcati su inserti Transwell trattati e non utilizzati per misure di flusso a resistenze di 2-5 K Ω · cm 2.

Per calcolare membrana plasmatica Pf . fluorescenza relativa (F (t ) /Fo ) È stato montato su una singola funzione esponenziale (come sopra) per studi sulle cellule FRT o una funzione biesponenziale (F (t ) /Fo = UN ·et / Τ1 + B ·et / Τ2 + C ) Per gli studi HBE. Membrana plasmatica Pf è stato calcolato come sopra descritto, in cui la superficie S è stato preso come la superficie apicale del monostrato cellulare, assumendo una superficie piana, liscia. L’altezza strato di cellule variabili nel tempo, h (t ), Era legato a ampiezze normalizzate in base alla riduzione finale del 50% previsto dalla altezza iniziale (ho ) In condizioni ipertoniche. Per FRT e le cellule HBE, ho è stato preso come rispettivamente 5 e 20 micron. Pf è stato quindi calcolato dalla dh (0) / dt = Pf · vw · (Φ1 – Φ2 ).

Fluorescenza a base di real-time RT-PCR è stato fatto per confrontare AQP3 relativa, AQP4, e l’espressione AQP5 mRNA in non-CF contro cellule FC che utilizzano il LightCycler ™ e con il kit LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I (Roche Diagnostics) secondo le istruzioni del produttore. Surface cellule epiteliali sono stati dissociato dal bronchi umano, surgelati e conservati a -80 ° C fino a quando scongelato per l’isolamento di RNA. primer PCR erano come descritto sopra. I risultati sono stati riportati come un normalizzato, il rapporto calibrato con tutti i campioni normalizzato per beta-actina. rapporti di concentrazione per ciascun campione CF e non CF sono stati calibrati per campioni calibratore (pooled cDNA da soggetti non-CF), con i risultati riportati come rapporto normalizzato con il campione calibratore come denominatore come segue: relative livello di mRNA = rapporto di campione (target / riferimento) / rapporto di calibratore (target / riferimento).

RISULTATI

Trasporto d’acqua in superficie epiteliale delle vie aeree è stata studiata utilizzando ben differenziati colture cellulari HBE. Transepithelial permeabilità all’acqua osmotica è stata misurata usando un metodo di diluizione colorante che Saggi flusso dell’acqua attraverso epiteli tenuta coltivate su filtri porosi (Fig. 2UN ). La fluorescenza di un marcatore volume di soluzione apicale fornito una lettura quantitativa di trasporto d’acqua osmoticamente guidato attraverso lo strato di cellule. Un gradiente osmotico indotto causato il movimento dell’acqua transepiteliale da cui permeabilità all’acqua osmotica (Pf ) È stato dedotto. Le culture non-CF P0 sono stati caratterizzati. Figura. 2B (superiore ) Mostra diluizione fluorescenza a 37 ° C, in cui un 300 m m pendenza d -mannitol indotto flusso dell’acqua osmotica nella soluzione apicale colorante contenente. Dati in assenza contro la presenza di amiloride (500 μ m) sono stati confrontati. Figura. 2C riassume transepiteliale Pf valori. Non c’era alcuna differenza significativa nel Pf con l’esposizione di P0 HBE culture a amiloride alte dosi (controllo contro amiloride, 54 ± 5 contro 52 ± 7 micron / s). concentrazioni più basse di amiloride (100 e 250 μ m), inoltre, non è cambiata Pf (non mostrato).

espressione AQP è stato caratterizzato in cellule P0 HBE. Ematossilina e sezioni di paraffina trasversali eosina macchiato confermato la differenziazione di 2 settimane di età culture in un ~ 20-micron di spessore dell’epitelio pseudostratificato con numerosi ciglia (Fig. 4UN ). Le colture sono state raschiate per l’analisi RT-PCR, che rilevato mRNA per diversi AQPs (Fig. 4B ). Trascrizioni di AQP3, AQP4, e AQP5 sono stati trovati in più alta abbondanza, in linea con studi precedenti (vedi “Discussione”). Minore è stato rilevato, ma non nulla espressione di AQP1, AQP6, e AQP7 mRNA. Quantitativa real-time RT-PCR è stato fatto per confrontare l’espressione dei principali AQPs in P0 HBE culture di non-CF contro CF vie respiratorie. Come riassunto in Fig. 4C . no state riscontrate differenze significative nell’espressione trascrizione AQP in non-CF contro cellule FC. Immunofluorescenza fatto su sezioni di paraffina di culture HBE e dei bronchi umani intatti dimostrato AQP3 e proteine ​​AQP4 espressione sulle membrane basolaterale, mentre l’espressione della proteina AQP5 non è stato rilevato. Controllo positivo colorazione del rene per AQP3 e AQP4 è mostrata e della ghiandola salivare per AQP5.

Abbiamo poi studiato i possibili effetti di amiloride sui principali AQPs polmonari, tra cui AQP1 (espresso in microvascolare endoteli), usando le cellule epiteliali AQP-trasfettate e polmone del mouse intatto. Transepiteliale e membrana plasmatica permeabilità acqua sono stati misurati in cellule FRT che ha espresso la proteina fluorescente gialla (controllo), AQP1, AQP3 o AQP4. Transepiteliale permeabilità all’acqua di linee cellulari FRT coltivate su supporti Transwell è stata misurata dopo le culture formano monostrati stretti elettricamente. permeabilità dell’acqua di AQP-cellule che esprimono FRT erano più grande di quello in cellule di controllo e non sensibile a amiloride (Fig. 5UN, superiore ). Figura. 5UN (parte inferiore ) Riassume transepiteliale Pf valori. Plasma permeabilità all’acqua della membrana è stato misurato sulle cellule FRT, con curve calceina fluorescenza montati funzioni esponenziali singoli (tracce rappresentativi dei FRT-AQP3 e cellule FRT-AQP4 mostrati in Fig. 5B, superiore ). In accordo con le misure di permeabilità all’acqua transepiteliale, membrana plasmatica Pf è stato aumentato con l’espressione AQP e non sensibile a amiloride (Fig. 5B, parte inferiore ).

DISCUSSIONE

Lo scopo principale di questo studio è stato quello di indagare su un meccanismo di AQP-dipendente ha proposto di tenere conto degli effetti clinici di soluzione salina ipertonica nebulizzata (HS) e amiloride sulla funzione polmonare in CF. La validità del meccanismo proposto di beneficio clinico che coinvolge AQPs vie aeree amiloride-sensibile ha importanti implicazioni per quanto riguarda l’uso di HS contro Agenti iperosmolari non sale nella terapia CF, così come nella proposta di utilizzare amiloride tipo inibitori ENAC prevenzione ASL disidratazione.

Lo spazio aereo-capillare permeabilità all’acqua nel polmone perfuso mouse.UN. tracce rappresentativi di pleurico superficie fluoresceina fluorescenza isotiocianato-destrano da wild-type del polmone mouse senza (a sinistra in alto ) e con (in alto a destra ) 500 μ m amiloride e dal polmone non trattati di topo AQP5-null (parte inferiore ). Ipertensione arteriosa polmonare perfusato osmolalità è indicato. B. sintesi dei tassi di capillare dello spazio aereo osmotico equilibrio da esperimenti come descritto per UN. (Quattro topi / condizione di ± S.E.). La differenza non era significativa.

Studi precedenti hanno riportato immunolocalizzazione l’espressione di AQP4 alla superficie della membrana basolaterale in cellule epiteliali in grandi e piccole vie aeree nei topi, ratti e gli esseri umani (rivisto in Rif. 30). AQP3 stato trovato per avere un modello di espressione più limitato a membrane basolaterale nelle cellule basali di grandi e centrali vie respiratorie e nasopharnyx. Diversi studi hanno dimostrato l’espressione di AQP1 in endoteli microvascolari attraverso le vie aeree / polmoni, ma non nelle cellule epiteliali (31. 32). AQP5 si esprime fortemente nel tipo I alveolari cellule epiteliali negli esseri umani e roditori e probabilmente in alcune cellule epiteliali delle vie aeree a grandi vie aeree umane (32. 33). In colture primarie ben differenziate di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane e in bronchi umano fisso, abbiamo trovato qui l’espressione di AQP3 e AQP4 nelle membrane basolaterale di epiteli delle vie aeree, ma non abbiamo rilevare l’espressione della proteina AQP5. Tuttavia, la mancanza di AQP5 immunostaining probabilmente riflette una mancanza di specificità anticorpale piuttosto che l’assenza di proteina funzionale, data la presenza dimostrato di AQP5 nasali e cellule epiteliali bronchiali in studi precedenti (33).

studi funzionali precedenti hanno suggerito il coinvolgimento di AQPs in permeabilità all’acqua delle vie aeree. Le nostre misurazioni iniziali nelle piccole vie aeree microperfused da cavie hanno mostrato permeabilità all’acqua alta transepiteliale (Pf ~ 50 micron / s), che era debolmente sensibile alla temperatura, ed è stato il mercurio-insensitive, suggerendo il coinvolgimento di AQP4 (7). Dati recenti provenienti da espianti sferoidali di polipi nasali umane previste prove per la funzione AQP5 in epiteli delle vie aeree. In questi grandi, monostrati di cellule delle vie aeree sferiche, con la membrana apicale ciliato rivolto verso l’esterno, Pederson et al. (9) ha riferito di alta membrana Pf (~150 Micron / s), che era sensibile a breve esposizione al mercurio a bassa concentrazione. Qui, il nostro alto Pf valori per culture HBE e la dipendenza dalla temperatura debole permeabilità suggeriscono movimento dell’acqua AQP-mediata (Fig. 2). Inoltre, la ridotta transepiteliale permeabilità all’acqua osmotica in basso pH nel basale (ma non apicale) soluzione membrana esposto costituisce una prova indiretta per la funzione di AQP3 (l’unica vie aeree pH regolato AQP) in HBE membrane basolaterale (19). L’aggiunta di HgCl2 alle culture utilizzati qui portato in netto leakiness con ridotta resistenza transepiteliale, precludendo conclusioni circa HgCl2 effetti. culture CF avevano simile permeabilità all’acqua a culture non-CF, in linea con i nostri dati di RT-PCR (Fig. 3C ) E con precedenti relazioni (8. 9).

Ringraziamenti

Ringraziamo Lorna Zlock e Jean Davidson per la preparazione di culture di epiteli delle vie aeree umano, il Dr. Michael Matthay per l’assistenza nell’acquisizione di campioni polmonari, il Dr. Dan Zhao per un aiuto con l’analisi RT-PCR, il Dr. Yaunlin canzone consulenza tecnica sulla polmone del mouse perfusione, e Liman Qian per l’allevamento del mouse e analisi del genotipo.

Le note

↵ 3 Le abbreviazioni utilizzate sono: CF, fibrosi cistica; CFTR, CF regolatore della conduttanza transmembrana; ASL, delle vie aeree superficie del liquido; AQP, aquaporin; FRT, Fisher ratto tiroide; RT, trascrizione inversa; PBS, PBS; HBE, epiteliali bronchiali umane; MES, acido 4-morpholineethanesulfonic; HS, soluzione salina ipertonica; ENaC, canale del sodio epiteliale.

  • Ricevuto 5 MAGGIO 2006.
  • Revisione ricevuto 5 luglio 2006.
  • L’American Society for Biochimica e Biologia Molecolare, Inc.

Riferimenti

Donaldson, S. H. Bennett, W. D. Zeman, K. L. Knowles, M. R. Tarran, R. Boucher, R. C. (2006) N. Engl. J. Med. 354. 241 -250

Elkins, M. R. Robinson, M. Rosa, B. R. Porto, C. Moriarty, C. P. Marks, G. B. Belousova, E. G. Xuan, W. Bye, P. T. e il National ipertonica salina nella fibrosi cistica (NHSCF) Study Group (2006) N. Engl. J. Med. 354. 229 -240

Robinson, M. Regnis, J. A. Bailey, D. L. King, M. Bautovich, G. J. and Bye, P. T. (1996) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153. 1503 -1509

Robinson, M. Hemming, A. L. Regnis, J. A. Wong, A. G. Bailey, D. L. Bautovich, G. J. King, M. and Bye, P. T. (1997) Thorax 52. 900 -903

Robinson, M. Daviskas, E. Eberl, S. Baker, J. Chan, H. K. Anderson, S. D. and Bye, P. T. (1999) Eur. Respir. J. 14. 678 -685

Eng, P. A. Morton, J. Douglass, J. A. Riedler, J. Wilson, J. e Robertson, C. F. (1996) Pediatr. Pulmonol. 21. 77 -83

Folkesson, H. Matthay, M. Frigeri, A. e Verkman, A. S. (1996), J. Clin. Investig. 97. 664 -671

Matsui, H. Davis, C. W. Tarran, R. Boucher, R. C. (2000), J. Clin. Investig. 105. 1419 -1427

Pedersen, P. S. Procida, K. Larsen, P. L. Holstein-Rathlou, N. H. e Frederiksen, O. (2005) Pfluegers Arch. 451. 464 -473

Song, Y. Jayaraman, S. Yang, B. Matthay, M. A. e Verkman, A. S. (2001) J. Gen. Physiol. 117. 573 -582

Yamaya, M. Finkbeiner, W. E. Chun, S. Y. e Widdicombe, J. H. (1992) Am. J. Physiol. 262. L713 -L724

Fulcher, M. L. Gabriel, S. Burns, K. A. Yankaskas, J. R. e Randell, S. H. (2005) Metodi di Mol. Med. 107. 183 -206

Pedemonte, N. Lukacs, G. L. Du, K. Caci, E. Zegarra-Moran, O. Galietta, L. J. e Verkman, A. S. (2005) J. Clin. Investig. 115. 2564 -2571

Saadoun, S. Papadopoulos, M. C. Hara-Chikuma, M. Verkman, A. S. (2005) Natura 434. 786 -792

Solenov, E. Watanabe, H. Manley, G. T. e Verkman, A. S. (2004) Am. J. Physiol. 286. C426 -C432

Levin, M. H. e Verkman, A. S. (2004) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45. 4423 -4432

Carter, E. P. Matthay, M. A. Farinas, J. e Verkman, A. S. (1996) J. Gen. Physiol. 108. 133 -142

Zeuthen, T. e Klairke, D. A. (1999), J. Biol. Chem. 274. 21631 -21.636

Ma, T. Fukuda, N. Song, Y. Matthay, M. A. e Verkman, A. S. (2000), J. Clin. Investig. 105. 93 -100

Daviskas, E. Anderson, S. Gonda D., I. Eberl, S. Miekle, S. Seale, J. P. e Bautovich, G. (1996) Eur. Respir. J. 9. 725 -732

Pavia, D. Thomson, M. L. Clarke, S. W. (1978) Am. Rev. Respir. Dis. 117. 199 -203

Daviskas, E. Anderson, S. D. Brannan, J. D. Chan, H. K. Eberl, S. e Bautovich, G. (1997) Eur. Respir. J. 10. 2449 -2454

Daviskas, E. Anderson, S. D. Gomes, K. Briffa, P. Cochrane, B. Chan, H. K. giovani, I. H. e Rubin, B. K. (2005) Respirology 10. 46 -56

Zabner, J. Seiler, M. P. Launspach, J. L. Karp, P. H. Kearney, W. R. Ecco, D. C. Smith, J. J. Welsh, M. J. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97. 11614 -11.619

Saijan, U. Moreira, J. Liu, M. Humar, A. Chaparro, C. Forstner, J. e Keshavjee, S. (2004) J. Heart Lung Transplant 23. 1382 -1391

Sood, N. Bennett, W. D. Zeman, K. Brown, J. Foy, C. e R. Boucher C. (2003) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167. 158 -163

App, E. M. King, M. Helfesrieder, R. Kohler, D. e Mattys, H. (1990) Am. Rev. Respir. Dis. 141. 605 -612

Hirsch, A. J. Sabater, J. R. Zamurs, A. Smith, R. T. Paradiso, A. M. Hopkins, S. Abramo, W. M. Boucher, R. C. (2004) J. Pharmacol. Exp. Ther. 311. 929 -938

Borok, Z. e Verkman, A. S. (2002), J. Appl. Physiol. 93. 2199 -2206

Hasegawa, H. Lian, S. C. Finkbeiner, W. E. e Verkman, A. S. (1994) Am. J. Physiol. 266. C893 -C903

Nielsen, S. King, L. S. Christensen, B. M. Agre, P. (1997) Am. J. Physiol. 273. C1541 -C1548

Kreda, S. M. Gynn, M. C. Fenstermacher, D. A. Boucher, R. C. e Gabriel, S. E. (2001) Am. J. Respir. Cellulare Mol. Biol. 24. 224 -234

Verkman, A. S. (2005) J. cellulare Sci. 118. 3225 -3232

Bai, C. Fukuda, N. Song, Y. Ma, T. Matthay, M. A. e Verkman, A. S. (1999), J. Clin. Investig. 103. 555 -561

Folkesson, H. G. Matthay, M. A. Hasegawa, H. Kheradmand, F. e Verkman, A. S. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91. 4970 -4974

Matthay, M. A. Folkesson, H. e Verkman, A. S. (1996) Am. J. Physiol. 270. L487 -L503

Fang, X. Fukuda, N. Barbry, P. Sartori, C. Verkman, A. S. e Matthay, M. A. (2002) J. Gen. Physiol. 119. 199 -207

Re, M. Dasgupta, B. Tomkiewicz, R. P. Brown, N. E. (1997) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156. 173 -177

Wills, P. J. Hall, L. R. Chan, W. e Cole, P. J. (1997), J. Clin. Investig. 99. 9 -13

Feng, W. Garrett, H. Speert, D. P. e Re, M. (1998) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157. 710 -714

Durairaj, L. Launspach, J. Watt, J. L. Businga, T. R. Kline, J. N. Thorne, P. S. e Zabner, J. (2004) Respir. Res. 5. 13

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